1.- Principios físicos del método.
Ecuaciones para el movimiento unidimensional de partículas a través de un fluido.
Centrifugación. Velocidad de sedimentación. Coeficiente de sedimentación
Las partículas en disolución pueden sufrir alteración espacial, es decir, pueden cambiar de posición con el tiempo. Esto puede ser debido a procesos de difusión (en un gradiente de concentración, las partículas tienden a ir de la zona de mayor concentración a la de de menor concentración) o bien a procesos de sedimentación.
A.- Sedimentación por gravedad.
Se produce Sedimentación por gravedad si la densidad de la partícula (ρ) es mayor que la densidad del disolvente (ρo). Esto se puede deducir a partir del Principio de Arquímedes.
Según este principio, cuando se sumerge un cuerpo en un fluido, el cuerpo experimenta una fuerza E (empuje) de sentido opuesto al Peso (P), que tiene igual valor que el peso del líquido que ha desplazado.
Este principio, también conocido como la Ley de Hidrostática, se aplica a los cuerpos, tanto en flotación, como sumergidos y a todos los fluidos. El principio de Arquímedes también hace posible la determinación de la densidad de un objeto de forma irregular, de manera que su volumen no se mide directamente. Si el objeto se pesa primero en el aire y luego en el en agua, entonces la diferencia de estos pesos igualará el peso del volumen del agua cambiado de sitio, que es igual al volumen del objeto. Así la densidad del objeto puede determinarse dividendo el peso entre el volumen.
Por lo tanto, sobre la partícula sumergida están actuando tres fuerzas, que favorecen (P) o dificultan (E, FR) el movimiento:
P: Peso de la partícula; P = mg --> P = ρgV
FR: Fuerza de resistencia al avance; FR = f Vs
E: Empuje; E = mg -->E = ρogV
Siendo:
m: masa de la partícula.
g: aceleración de la gravedad.
ρ: densidad de la partícula.
ρo: densidad del disolvente.
V: volumen del cuerpo y del fluido desplazado.
f: coeficiente de fricción.
Vs: velocidad de sedimentación.
E = mg = ρogV
P = mg = ρgV
Fuerza Total = FT = P - E = (ρ - ρo )gV
Por lo tanto, para que haya sedimentación por gravedad, debe cumplirse que ρ > ρo
B.- Ecuaciones para el movimiento unidimensional de partículas a través de un fluido.
Consideremos una partícula de masa m moviéndose a través de un fluido por la acción de una fuerza externa Fc. Sea v la velocidad de la partícula con relación al fluido, Fb la fuerza de empuje sobre la partícula y Fd la fuerza de resistencia al avance o de retardo.
La fuerza resultante que actúa sobre la partícula es FC – Fb – Fd.
La aceleración de la partícula es dv/dt y de acuerdo con la Ley de Newton:
F = (m /gc) (dv / dt)
(m / gc) (dv / dt) = Fc – Fb – Fd (1)
La fuerza externa puede ser expresada como el producto de la masa por la aceleración de la partícula:
Fc = (m a) / gc (2)
La fuerza de empuje, por el principio de Arquímedes, es igual al producto de la masa del fluido que desplaza la partícula por la aceleración producida por la fuerza externa. El volumen de la partícula y por consiguiente el de fluido desplazado, es igual a m/r siendo r la densidad de la partícula. La masa de fluido desplazado es igual a (m/r)ro siendo ro la densidad del fluido. La fuerza de empuje es por lo tanto:
Fb = (m a) / (r gc) (3)
La fuerza de retardo es Fd = (Cd vo2 ro Ap) / (2gc) (4)
Siendo Cd un coeficiente adimensional de retardo y Ap el área proyectada por la partícula sobre un plano perpendicular a la dirección del movimiento de la misma. Por otra parte la velocidad de aproximación del fluido vo es igual a la velocidad de la partícula v.
Sustituyendo estos valores de las fuerzas en la ecuación (1) se obtiene que:
dv/dt = a (1 – ro / r ) – (Cd v2 rf Ap ) / (2 m)
Algunos de los principios básicos en la teoría de la sedimentación se derivan de la Ley de Stokes. Para simplificar el problema se suele considerar que las partículas a aislar en Biología son esferas; cuando éstas se encuentran en un campo gravitacional y alcanzan una velocidad constante, la fuerza neta sobre cada esfera es igual a la fuerza de resistencia que opone el líquido a su movimiento. En este caso particular de la ley de Stokes se comprueba qué:
· la velocidad de sedimentación de cada partícula es proporcional a su tamaño,
· la velocidad de sedimentación es proporcional a la densidad de la partícula y a la del medio,
· la velocidad de sedimentación es nula cuando ambas densidades se igualan,
· La velocidad de sedimentación disminuye al aumentar la viscosidad del medio, y
· la velocidad de sedimentación aumenta al aumentar el campo de fuerza.
Las velocidades de sedimentación que se dan en condiciones naturales son muy bajas. A veces interesa incrementar esa velocidad de sedimentación, para lo que se utiliza la técnica de la CENTRIFUGACIÓN.
La centrifugación es una técnica de separación de partículas que se basa en la distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo.
Cuando se centrifuga una solución, se rompe la homogeneidad y se produce la separación del soluto y del disolvente. Las primeras partículas en sedimentar son las de mayor masa.
Fuerzas que actúan sobre la partícula:
Peso (P)
Fuerza centrífuga (Fc) debido al giro que experimenta.
La suma de estas dos fuerzas da como resultante otra fuerza denominada Peso Efectivo (PE); es la fuerza que realmente produce la sedimentación, la que lleva la partícula al fondo del tubo:
PE = P + Fc = m (g + ac) à PE = m gE (gE à gravedad efectiva)
Módulo de la gE à | gE | = √ g2 + ac2
ac = w2 r
w = velocidad angular = dα / dt
α = ángulo respecto al eje de giro
En la centrifugación: gE = √ g2 + (w2 r) 2
Si g <<<< w2 r à se puede despreciar el término más pequeño à gE =w2 r
Empuje efectivo (Ee):
Ee = ρo gE V = (ρo / ρ ) m gE
Fuerza de resistencia al avance (Fd)= Peso efectivo (PE) – Empuje efectivo (Ee)=
M gE – (ρo / ρ ) m gE = f Vs
Vs
= m gE (1 - ρo
/ ρ) / f
Vs = velocidad de sedimentación:
- Proporcional a la masa de la partícula. Esta propiedad es la que permite separar partículas con diferente masa. Cuanto mayor sea la masa de la partícula mayor es la velocidad de sedimentación.
- gE es el término que provoca la sedimentación forzada. Para sedimentar antes se puede aumentar la velocidad angular (w). En esto se basan las ULTRACENTRÍFUGAS que permiten separar partículas de muy similar masa debido a las altas velocidades a las que trabajan.
- El resto de términos no se pueden modificar.
La velocidad de sedimentación es útil para caracterizar partículas, pero en Bioquímica se emplea otra unidad: el coeficiente de sedimentación.
Volumen específico à V = 1 / ρ
Sustituimos en la ecuación de Vs y queda:
Vs / r w2 = m (1 – V ρo ) / f
Coeficiente de sedimentación à s = Vs / r w2 à Unidades de tiempo (segundos), pero siempre tiene un valor muy bajo, por lo para medir el coeficiente de sedimentación se usa otra unidad: el Svedber (1 Svedber (S) = 10 -13 segundos ).
El conocer s nos facilita:
- Caracterizar la partícula y obtener información sobre su tamaño, densidad y forma.
- Conocer su comportamiento en la centrifugación (facilita el diseño de métodos para su aislamiento.
A partir de la ecuación del coeficiente de sedimentación se puede calcular la masa molecular (M) de las sustancias que se centrifugan:
Si multiplicamos y dividimos la ecuación por el número de Avogadro (NA) y teniendo en cuenta que NA multiplicado por la masa de las partículas es igual a la masa molecular (M) de la sustancia:
M = ( f s NA ) / ( 1- V ρo )
Como D = ( RT ) / ( f NA ) à M = (RTs) / D (1 - V ρo )
El cálculo de la masa molecular de sustancias por centrifugación se explica con más detalle en el apartado de aplicaciones de la centrifugación analítica.
