El primer cortometraje de este director canario es Esposados (1996), comedia rodada en blanco y negro protagonizada por Anabel Alonso. La obra, nominada al Oscar al Mejor Cortometraje, fue elegida Mejor Cortometraje en el Festival de Cortos de Alcalá de Henares (Madrid), en el Festival de Cine de Gijón (Asturias) y en la Semana Internacional de Cine Fantástico del Festival de Málaga.

Su primer largometraje es Intacto (2001), protagonizado por Leonardo Sbaraglia. Con ella, Fresnadillo ganó el Premio Revelación y el Premio al Mejor Montaje del Círculo de Escritores Cinematográficos, los Premios a la Mejor Película y al Mejor Guión en el Festival de Cine Fantástico de Oporto (Fantasporto) en Portugal, además del Goya al Mejor Dirección Novel.

En 2002, rodó en blanco y negro el cortometraje Psicotaxi. Su siguiente y último trabajo es el filme de terror 28 días después (2007), una secuela de la película 28 weeks later (2002), dirigida por Danny Boyle, en la que un virus arrasa Gran Bretaña, mientras que los estadounidenses ganan la batalla a la infección. Rodado en Inglaterra, la cinta ha obtenido un gran éxito en taquilla.

Juan Carlos Fresnadillo se ha convertido en el primer cineasta español que va a trabajar con Steven Spielberg en el largometraje Wednesday, que comienzará a rodarse a comienzos de 2008 en Los Ángeles. La historia de la película trata sobre un hombre que vive una situación límite y que se ve obligado a escapar de la policía durante 24 horas.